• 干貨|細胞培養之二十問答

    1. 冷凍管應如何解凍?

            取出冷凍管后,須立即放入37°C水槽中快速解凍,輕搖冷凍管使其在1分鐘內全部融化,并注意水面不可超過冷凍管蓋沿,否則容易發生污染。另冷凍管由液氮桶中取出解凍時,必須注意安全,預防冷凍管爆裂。

    2. 細胞冷凍管解凍培養時,是否應馬上去除DMSO?

            除少數特別注明對DMSO敏感之細胞外,絕大部分細胞株(包括懸浮性細胞)在解凍之后應直接放入含有10-15ml新鮮培養基的培養瓶中,待隔天再置換新鮮培養基去除DMSO即可,可避免大部分解凍后細胞無法生長或貼附的問題。

    3. 能否使用與原先培養條件不同的培養基?

            不能。每一種細胞株均有其特定的細胞培養基,若驟然使用和原先提供培養條件不同的培養基,細胞大多無法立即適應,造成細胞無法存活。

    4. 能否使用與原先培養條件不同的血清種類?

            不能。血清是細胞培養上一個極為重要的營養來源,血清的種類和品質對細胞的生長會產生極大影響。來自不同物種的血清,在一些物質或分子的量或內容物上都有所不同,血清使用錯誤常會造成細胞無法存活。

    5. 何謂FBS,FCS,CS,HS ?

            FBS (fetal bovine serum)和FCS (fetal calf serum)是相同的意思,兩者都是指胎牛血清,FCS乃錯誤的使用字眼,請不要再使用。CS (calf serum) 則是指小牛血清。HS (horse serum) 則是指馬血清。

    6. 培養細胞時應使用5%或10%的CO2?或根本沒有影響?

            一般培養基中大都使用 HCO3-/CO32-/H+ 作為pH的緩沖系統,而培養基中NaHCO3的含量將決定細胞培養時應使用的CO2濃度。當培養基中 NaHCO3含量為每公升3.7g時,細胞培養時應使用 10%的CO2;當培養基中 NaHCO3為每公升1.5g時, 則應使用5%的CO2培養細胞。

    7.何時須更換培養基?

            視細胞生長密度而定,或遵照細胞株基本數據上的更換時間,按時更換培養基即可。

    8.培養基中是否須添加抗生素?

            除特殊篩選系統外,一般正常培養狀態下,培養基中不應添加任何抗生素。

    9.附著性細胞繼代時所使用之trypsin-EDTA濃度?應如何處理?

            一般使用之trypsin-EDTA濃度為0.05% trypsin-0.53mM EDTA-4Na。第一次開瓶后應立即少量分裝于無菌試管中,保存于–20°C,避免反復冷凍解凍造成trypsin的活性降低,并減少污染的機會。

    10.懸浮性細胞應如何傳代處理?

            一般僅需持續加入新鮮培養基于原培養瓶中,稀釋細胞濃度即可。若培養液太多,可將培養瓶口端稍微抬高,直到無法容納為止。分瓶時取出一部份含細胞的培養液至另一個新的培養瓶,加入新鮮培養基稀釋至適當濃度,重復前述步驟即可。

    11. 如果想要將一般動物細胞離心下來,其離心速率應為多少轉速?

            如果想要回收動物細胞,其離心速率一般為300xg (約1,000 rpm),5-10分鐘,過高的轉速,會造成細胞死亡。

    12.細胞的接種密度如何確定?

            依照細胞株基本數據上的接種密度或稀釋的比例接種即可。細胞數太少或稀釋的太多都是造成細胞無法生長的原因。

    13.細胞冷凍培養基的成份是什么?

            動物細胞冷凍保存時最常使用的冷凍培養基是含5-10% DMSO (dimethyl sulfoxide) 和90-95%原來細胞生長用的新鮮培養基均勻混合。注意:由DMSO稀釋時會放出大量熱能,所以不可將DMSO直接加入細胞液中, 必須使用前先行配制完成。

    14.DMSO的等級和無菌過濾的方式是什么?

            冷凍保存使用的DMSO等級,必須為細胞培養級的DMSO(如Sigma D2650),其本身為無菌狀況。第一次開瓶后應立即少量分裝于無菌試管中,保存于4°C,避免反復冷凍解凍造成DMSO的裂解而釋出有害物質,并可減少污染的機會。若要過濾DMSO,則須使用耐DMSO的尼龍材質濾膜。

    15.冷凍保存細胞的方法?

            冷凍保存方法一:冷凍管置于4°C 30-60分鐘(-20°C 30分鐘),-80°C 16-18小時(或隔夜),液氮可長期儲存。

            冷凍保存方法二:冷凍管置于已設定程序的可程序降溫機中每分鐘降1-3°C至–80°C以下,再放入液氮可長期儲存。-20°C不可超過1小時,以防止冰晶過大,造成細胞大量死亡,也可跳過此步驟直接放入-80°C冰箱中,但存活率會略有降低。

    16.細胞想要冷凍保存時,細胞冷凍管內應細胞濃度應該多少?

            冷凍管內細胞數目一般為每管1x106 cells/ml,融合瘤細胞則以每管5x106 cells/ml為宜。

     17.應如何避免細胞污染?

            細胞污染的種類可分為細菌、酵母菌、霉菌、病毒和霉漿菌等。主要的污染原因為無菌操作技術不當、操作室環境不佳、污染的血清和污染的細胞等。嚴格的無菌操作技術、清潔的環境、與品質良好的細胞來源和培養基配制是減低污染的最好方法。

    18.如果細胞發生微生物污染時,應如何處理?

            直接滅菌后丟棄。

    19.支原體(mycoplasma)污染的細胞,是否可以肉眼觀察出異狀?

            不能。除極有經驗的專家外,大多數遭受支原體污染的細胞株, 無法以其外觀分辨。

    20.支原體污染會對細胞培養有何影響?

            支原體污染幾乎可影響所有細胞的生長及代謝。所以進行實驗前,必須確認細胞為mycoplasma-free,實驗結果的數據才有意義。

    北京pk10技巧5码选位置